Cuando las burbujas de aire entran en una cromatografía líquida durante un experimento, muchos trabajadores de laboratorio seguramente fruncirán el ceño: no sólo aumentan el ruido de referencia y producen molestos picos fantasma, sino que, lo que es más importante, afectan directamente la precisión y repetibilidad de los resultados cuantitativos, arruinando potencialmente todo el trabajo duro.
Pero que no cunda el pánico. Existe una forma sistemática de abordar las burbujas. Recuerde el principio “primero prevenir, luego diagnosticar y finalmente tratar”, y podrá manejar el problema fácilmente.
I. La prevención primero: eliminar las burbujas en su origen
La mejor manera de lidiar con las burbujas es evitar que aparezcan. Esto requiere buenos hábitos operativos, con los siguientes puntos clave:
No te saltes la desgasificación en fase móvil
¿Por qué es tan importante la desgasificación? Cuando la fase móvil se lleva de un área de almacenamiento fría al laboratorio, o cuando se calienta durante su uso, el aire disuelto puede salir de la solución y formar burbujas en la bomba o el detector.
¿Qué hacer? La mayoría de los instrumentos modernos tienen un desgasificador en línea: manténgalo encendido. Antes de su uso, es mejor sonicar la fase móvil preparada durante 10 a 20 minutos, especialmente las fases acuosas o soluciones con una alta proporción de sales tampón. Para análisis extremadamente exigentes, la pulverización de helio es una alternativa fiable.
Preste atención al manejo de solventes.
Al preparar la fase móvil, evite una mezcla desigual. Por ejemplo, una gran diferencia de proporción entre las fases orgánica y acuosa (por ejemplo, 90 % de agua con 10 % de materia orgánica) es particularmente propensa a la formación de burbujas. Se recomienda agregar lentamente la fase acuosa a la fase orgánica, o utilizar un agitador magnético para ayudar a la mezcla. Además, intente utilizar disolventes de calidad HPLC: son más puros, contienen menos impurezas y es menos probable que generen burbujas.
Sea minucioso durante el inicio y el cebado del sistema.
Antes de poner en marcha el instrumento, especialmente después de cambiar la fase móvil, utilice siempre la función "Purga" a un caudal relativamente alto (p. ej., 5 ml/min) para expulsar las burbujas de la bomba y del desgasificador en línea. Al mismo tiempo, utilice una jeringa para extraer líquido de la salida de la válvula de purga hasta que no se vean burbujas. Si el método comienza con un caudal inicial alto, no lo aplique directamente. En su lugar, establezca un gradiente que aumente desde un caudal bajo (p. ej., 0,2 ml/min) hasta el caudal objetivo, dando tiempo al sistema para adaptarse a la presión.
II. Diagnóstico: ¿Dónde están las burbujas?
Si observa fluctuaciones de presión, ruido de referencia o tiempos de retención inestables, no se apresure a tomar medidas. Primero, determine dónde se encuentran las burbujas.
Burbujas en la bomba: La presión variará mucho, llegando a veces incluso a cero.
Burbujas en el detector.: La línea de base mostrará picos de ruido puntiagudos y regulares.
Burbujas en la columna.: Las formas de los picos se deteriorarán, los picos pueden dividirse y los tiempos de retención variarán.
III. Tratamiento: Eliminación de burbujas paso a paso
Una vez que haya identificado la ubicación de la burbuja, siga estos pasos metódicamente; no entre en pánico.
Paso 1: detener la inyección y la detección inmediatamente
Detenga la adquisición de datos y apague la lámpara detectora (p. ej., lámpara DAD/UV): las lámparas de deuterio son caras y es necesario protegerlas.
Paso 2: retrolavado de la columna (recomendado)
Este método es eficaz y causa poco daño a la columna. Primero, desconecte la salida de la columna del detector y conéctela al puerto de desechos del inyector o directamente a una botella de desechos. Luego reduzca el caudal de la bomba (p. ej., 0,2‑0,5 ml/min) y lave la columna con fase móvil durante 1‑2 minutos. La presión de la columna ayudará a expulsar las burbujas del extremo que se conecta a la bomba; ese extremo tiene una frita de poros más grandes y es menos probable que se obstruya.
Un recordatorio: antes del retrolavado, confirme que la columna se puede utilizar a la inversa (la mayoría de las columnas modernas sí). Después del retrolavado, vuelva a instalar la columna en la dirección correcta.
Paso 3: enjuague todo el sistema con un caudal más alto
Después de reinstalar la columna, primero desconecte el detector y coloque la entrada del detector en una botella de desechos. Lave el sistema a un caudal más alto (p. ej., 2 a 3 ml/min, pero no exceda el límite de presión de la columna) durante 5 a 10 minutos para empujar las burbujas restantes hacia los desechos.
Paso 4: reequilibrar el sistema
Vuelva a conectar el detector y equilibre el sistema al caudal inicial especificado por el método analítico. Espere hasta que la línea de base esté estable y la presión sea estable antes de continuar con sus experimentos.
IV. Caso especial: burbujas atascadas en la bomba
Si quedan burbujas atrapadas en las válvulas de retención de la bomba, es posible que la bomba no funcione correctamente. En este caso, utilice la función "Purga" del instrumento o abra la válvula de purga y enjuague la bomba a un caudal alto. También puedes utilizar una jeringa en la salida de la válvula de purga para aspirar repetidamente, ayudando a expulsar las burbujas. A veces, golpear suavemente las válvulas de retención también puede desalojar las burbujas atrapadas.
Recordatorios finales:
Siempre es mejor prevenir que curar: siga siempre los procedimientos de desgasificación adecuados.
Cuando ocurra un problema, primero localice con precisión la posición de la burbuja.
Durante la eliminación de burbujas, evite caudales o presiones excesivamente altos para evitar dañar la columna o el instrumento.
Si ninguno de estos métodos funciona, puede haber otro problema, como una fuga en el sistema; no lo fuerce; póngase en contacto con un ingeniero de instrumentos lo antes posible.
