Los detalles operativos pueden variar ligeramente entre diferentes marcas y modelos de HPLC, pero las ideas centrales y la lógica operativa son las mismas. Recuerde la vieja regla: “Lave antes de comenzar, limpie a fondo después de terminar.”
I. Preparación antes del análisis
Preparación de la fase móvil
Selección de solventes: Utilice disolventes de grado HPLC o más puros; de lo contrario, las impurezas pueden causar alteraciones de la línea base.
Pureza del agua: Utilice agua ultrapura de 18,2 MΩ·cm, preferiblemente recién preparada, para evitar el crecimiento microbiano que podría dañar la columna y afectar la detección.
Filtración: Todas las fases móviles deben filtrarse al vacío a través de una membrana de 0,45 μm o 0,22 μm antes de su uso para eliminar las partículas finas; de lo contrario, el sistema o la columna podrían bloquearse.
Desgasificación: Se deben eliminar las burbujas en la fase móvil, de lo contrario pueden provocar fluctuaciones de presión y perturbaciones en la línea base en la bomba o el detector. Los métodos comunes incluyen desgasificación en línea, sonicación, rociado de helio y filtración al vacío.
Preparación de muestras
La muestra debe estar completamente disuelta; la solución resultante debe ser transparente y libre de partículas sólidas.
Se recomienda disolver la muestra en un disolvente que coincida con la composición de la fase móvil inicial para evitar efectos del disolvente que puedan distorsionar las formas de los picos.
Recordatorio especial : Antes de la inyección, la solución de muestra debe filtrarse a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
Verificación de columna
Confirme que el tipo de columna (C18, C8, columna amino, etc.) coincida con el método analítico y las propiedades de la muestra.
Verifique el certificado de desempeño de la columna; la eficiencia y la presión de la columna deben estar dentro de rangos aceptables.
Comprobar el entorno del laboratorio
Asegúrese de que haya suficiente espacio en la botella de residuos y que la fuente de alimentación y los gases necesarios funcionen correctamente.
II. Puesta en marcha, lavado y equilibrio del sistema (“calentamiento”)
Secuencia de inicio correcta
Encienda la computadora → encienda los módulos del instrumento (encendido) → inicie el software de la estación de trabajo.
Esto garantiza que el software reconozca y se conecte correctamente a cada módulo, lo que reduce los errores.
Instale la columna y lave el sistema
Conecte la columna a la ruta del flujo, prestando atención a que la flecha en la etiqueta de la columna se alinee con la dirección del flujo de la fase móvil.
Paso clave: Inicie la bomba a un caudal bajo (por ejemplo, 0,2–0,5 ml/min) utilizando la relación de fase móvil requerida para el método, luego aumente gradualmente hasta el caudal de trabajo. Esto evita golpes de alta presión que podrían dañar la columna y el sistema.
Verifique todas las conexiones en busca de fugas.
Equilibrio del sistema
Mantenga el caudal de trabajo y permita que la fase móvil lave continuamente la columna y todo el recorrido del flujo hasta que:
Línea base estable: La línea de señal en la estación de trabajo es recta, sin derivaciones ni picos.
Presión estable: Las fluctuaciones de presión del sistema son generalmente inferiores al ±1%.
El equilibrio suele tardar entre 10 y 30 minutos; Los métodos de gradiente pueden tardar más.
III. Configuración de métodos y análisis de muestras
Método de creación/recuperación
Configure los parámetros con precisión en el software de cromatografía, incluido el caudal, la relación de fase móvil, la temperatura del horno de columna, la longitud de onda de detección, el tiempo de ejecución, el volumen de inyección, etc.
Observar la línea de base
Confirme que la línea base sea estable antes de prepararse para la inyección.
Operación de inyección (para inyección manual sin un inicio activado por inyección)
Usando una jeringa adecuada, enjuáguela varias veces con la solución de muestra y luego extraiga un volumen ligeramente mayor que el volumen de inyección.
Gire la válvula de inyección a la posición "Cargar". Inserte completamente la aguja en el puerto, inyecte rápidamente la muestra y luego retire la aguja.
Gire inmediatamente la válvula a la posición "Inyectar" y simultáneamente haga clic en "Iniciar" en la estación de trabajo para comenzar la adquisición de datos.
Nota: La acción debe ser rápida y fluida; no haga pausas demasiado largas entre “Cargar” e “Inyectar”.
IV. Parada y mantenimiento (“Trabajos de acabado adecuados”)
Lavar el sistema (paso importante)
Una vez finalizado el análisis, haga no Detenga la bomba directamente.
Elija un solvente apropiado para lavar completamente el sistema, según el tipo de fase móvil utilizada.
Si se utilizó una sal tampón: Primero enjuague con una fase móvil con alto contenido de agua (p. ej., 90 % de agua) durante 30 a 60 minutos para eliminar la sal, luego enjuague con una fase móvil con alto contenido de agua (p. ej., 90 % de metanol o acetonitrilo) durante 30 a 60 minutos para reemplazar el agua, evitando el crecimiento microbiano o la precipitación de sal.
Si no se utilizó sal tampón: Enjuague directamente con una fase rica en materia orgánica (p. ej., 90 % de metanol o acetonitrilo) durante al menos 30 minutos.
Secuencia de apagado correcta
Detenga la bomba → apague la lámpara del detector (especialmente la lámpara UV, para prolongar su vida útil) → cierre el software de la estación de trabajo → apague el instrumento → finalmente apague la computadora.
Almacenamiento de columnas
Retire la columna, tape ambos extremos y guárdela según las instrucciones del fabricante.
Entrada del libro de registro
Registre los detalles de uso del instrumento, incluido el nombre del usuario, la muestra, el método, el estado del instrumento, etc., para referencia futura.
