Al realizar un análisis HPLC, pocas cosas son más frustrantes que su instrumento "actúa mal" de repente: la presión aumenta inexplicablemente, los picos se distorsionan, los tiempos de retención oscilan hacia adelante y hacia atrás... En la mayoría de los casos, el culpable es una columna bloqueada. No entrar en pánico. Con un conjunto práctico de métodos de desbloqueo y resolución de problemas, puede devolverle la vida a su columna, extender su vida útil y ahorrarle costos considerables a su laboratorio.
Para solucionar el problema, primero debes confirmarlo. Cuando su sistema HPLC muestra estas "señales anormales", debe sospechar que hay una columna bloqueada.:
Presión anormalmente alta: Ésta es la señal más obvia. La presión del sistema es significativamente mayor que cuando se estableció el método por primera vez, o aumenta rápidamente en un corto período de tiempo.
Picos distorsionados: Los picos se vuelven irregulares (división, cola, frente), las áreas de los picos disminuyen notablemente y el rendimiento de separación se deteriora.
Deriva del tiempo de retención: El tiempo de retención del compuesto objetivo se vuelve inestable y cambia considerablemente.
Fluctuación de presión severa: La presión sube y baja de forma errática incluso cuando no se inyecta ninguna muestra.
Cuando vea alta presión, no culpe automáticamente a la columna; otras partes del sistema también pueden tener la culpa. Un simple "método de desconexión" puede ayudarle a identificar el problema:
Desconectar la columna: Retire la columna del recorrido del flujo y conecte la bomba directamente al detector mediante una unión o un conector de volumen muerto cero.
Ejecute el método: Lave el sistema al caudal normal.
Observa la presión:
Si la presión permanece alta, la obstrucción está en algún lugar antes de la columna, posiblemente en el filtro de entrada, la columna protectora, el filtro en línea o la tubería. Estos deben revisarse individualmente, limpiarse o reemplazarse.
Si la presión vuelve a la normalidad, lo más probable es que el problema esté en el columna hplc en sí mismo o en la columna de guardia. Intente quitar o reemplazar la columna de protección primero. Si la presión vuelve a ser normal, la guardacolumna está sucia.
Si la presión permanece alta, entonces la columna analítica está bloqueada.
Una vez que haya confirmado que la columna está bloqueada, la limpieza debe seguir el principio "de suave a fuerte". No comience con disolventes agresivos y caudales altos, ya que esto puede causar daños secundarios a la columna.
La mayoría de las columnas analíticas permiten el lavado inverso (¡pero siempre consulte primero el manual!). Invierta las conexiones de entrada y salida de la columna y enjuague con una fase móvil adecuada. Esto puede eliminar las partículas contaminantes atrapadas en la entrada de la columna.
Nota: Algunas columnas especialmente adheridas, por ejemplo, ciertas columnas de análisis de azúcar, no se recomiendan para lavado inverso. Consulte siempre el manual de instrucciones antes de continuar.
Dependiendo de la naturaleza de los contaminantes (p. ej., lípidos, proteínas, sustancias altamente hidrófobas), elija una secuencia adecuada de disolventes de limpieza. Antes de limpiar, asegúrese de que todos los disolventes sean miscibles con la fase móvil actual para evitar la precipitación de sal.
Secuencia de limpieza recomendada:
Primero, enjuague con agua pura (o 95 % de agua + 5 % orgánico) a un caudal bajo (0,2‑0,5 ml/min) durante 30 volúmenes de columna para eliminar las sales del tampón.
Luego enjuague con un disolvente fuerte (por ejemplo, acetonitrilo o metanol) a un caudal bajo durante 30 volúmenes de columna.
Para contaminantes orgánicos: siga la secuencia: acetonitrilo → isopropanol → diclorometano (o cloroformo; verifique la compatibilidad de la columna) → isopropanol → acetonitrilo. Enjuague con cada disolvente a un caudal bajo para 20-30 volúmenes de columna.
Para muestras biológicas/proteicas: se puede utilizar una secuencia como TFA al 0,1% en agua → acetonitrilo → isopropanol.
Finalmente, reequilibre la columna con la fase móvil inicial.
Si la limpieza no funciona, es posible que la frita de entrada esté gravemente obstruida. Los usuarios experimentados pueden intentar reemplazar la frita de entrada bajo la guía del fabricante. Sin embargo, esto conlleva cierto riesgo de perturbar el lecho abarrotado. Para columnas valiosas, puede ser mejor contactar al fabricante para una regeneración profesional.
Si todo lo demás falla y la columna está fuera de garantía y no es muy costosa, puede intentar lo siguiente: retire el extremo de la columna, limpie suavemente la frita con un paño suave humedecido con solvente o límpiela con cuidado con una aguja muy fina. Esta operación es muy arriesgada: probablemente afectará la eficiencia de la columna y la dañará fácilmente. Sólo debe intentarse como un último esfuerzo, en el entendido de que es posible que no tenga éxito.
De hecho, el 90% de los problemas de obstrucción se pueden evitar con buenos hábitos operativos. Prevenir problemas es mucho más fácil que solucionarlos:
Utilice siempre una columna de protección: Una precolumna actúa como un “escudo” para su columna analítica, atrapando eficazmente partículas y compuestos fuertemente retenidos a bajo costo.
Prepare las muestras adecuadamente: Todas las muestras deben filtrarse a través de membranas de 0,22 µm o 0,45 µm para eliminar completamente las partículas finas.
Maneje las fases móviles con cuidado: Todas las fases móviles, especialmente las soluciones acuosas y las sales tampón, deben prepararse con reactivos de alta pureza y filtrarse/desgasificarse al vacío. Los tampones se deben preparar recientemente y utilizar con prontitud para evitar el crecimiento microbiano.
Utilice una transición adecuada al cambiar de fase móvil: Después de un análisis con sales tampón, debe enjuagar con una fase con alto contenido de agua (>10 % de agua) durante al menos 30 minutos a un caudal adecuado para eliminar completamente las sales antes de cambiar a disolvente orgánico para su almacenamiento. Nunca deje la columna en una solución tampón durante períodos prolongados.
Sea amable con la operación: Evite cambios drásticos en el caudal y la presión, y respete los límites de pH y presión de la columna.
La columna es el “corazón” de su método HPLC: es importante y también costosa. Dominar las técnicas adecuadas de manejo de bloqueos y mantenimiento diario no solo le ahorrará un valioso tiempo de experimento y costos de reparación, sino que también garantizará la precisión y confiabilidad de sus datos analíticos. La próxima vez que vea que la presión aumenta, podrá responder con calma y hacer que su cromatógrafo vuelva a funcionar de manera eficiente rápidamente.
