La columna de cromatografía líquida es el componente principal de cualquier sistema de análisis LC. La precisión de los resultados experimentales depende a menudo del uso correcto y del mantenimiento adecuado. Sólo utilizando y manteniendo la columna correctamente se pueden garantizar datos analíticos fiables en todo momento.
I. Instrucciones para el uso de la columna
Precauciones antes de usar
El disolvente de almacenamiento en una columna nueva generalmente es la fase móvil especificada en su informe de prueba de rendimiento. Antes de usar la columna, confirme que este disolvente de almacenamiento sea miscible con la fase móvil que desea utilizar para sus muestras. No los mezcle directamente sin verificación. Para la cromatografía de fase inversa, si el eluyente contiene una alta concentración de sal o un tampón, se recomienda lavar primero la columna con un eluyente de disolvente orgánico de baja concentración (10 %) para evitar la precipitación de sal y el bloqueo de la columna.
Requisitos de la fase móvil
Se recomienda utilizar disolventes orgánicos de grado HPLC y agua ultrapura al preparar la fase móvil. Si la fase móvil contiene sal, se debe filtrar a través de una membrana de 0,45 μm. Los contenedores de fase móvil y los filtros en línea también deben limpiarse periódicamente para evitar la acumulación de partículas impurezas.
Las fases unidas a base de sílice convencionales son adecuadas para su uso en el rango de pH de 2,0 a 8,0. Al analizar compuestos básicos, un empaque BDS C18 es más apropiado ya que tolera un rango de pH de 2,0 a 10,0. Sin embargo, si la columna se utiliza cerca del límite de pH, se debe limpiar inmediatamente con un disolvente adecuado después de su uso.
Preparación de muestras
Las muestras deben tratarse previamente, por ejemplo, utilizando un filtro de muestra o una columna de extracción en fase sólida (SPE). Para muestras difíciles, agregar una precolumna puede ahorrar muchos problemas. Además, para la cromatografía en fase normal, todos los disolventes y muestras deben estar estrictamente deshidratados; de lo contrario, los resultados analíticos pueden verse afectados.
II. Métodos de almacenamiento de columnas
Mantenimiento diario
Después de cada uso de un tampón o una fase móvil que contenga sal, primero lave la columna con 10 % de metanol/agua durante 30 minutos para eliminar la sal y luego lave con metanol puro durante 30 minutos. Nota: No enjuague solo con agua pura, ya que esto puede provocar que el empaque colapse y dañe la columna.
Almacenamiento a largo plazo
Los diferentes tipos de columnas requieren diferentes condiciones de almacenamiento:
Columnas de fase invertida: almacenar en metanol puro o acetonitrilo.
Columnas de fase normal: almacenar en hexano puro deshidratado.
Columnas de intercambio iónico: almacenar en una solución acuosa que contenga azida de sodio.
Al almacenar, reemplace siempre los terminales originales (tapones) y mantenga la columna a temperatura ambiente.
III. Regeneración de columnas
Regeneración de columnas en fase invertida
Lave la columna con 20-30 volúmenes de columna de los siguientes disolventes en secuencia:
Primero: metanol/agua (10/90, V/V) → luego acetonitrilo → luego isopropanol.
Después de eso, enjuague en orden inverso: isopropanol → acetonitrilo → metanol/agua (10/90).
Regeneración de columna en fase normal
Lave la columna con 20-30 volúmenes de columna de los siguientes disolventes en secuencia:
Primero: hexano → luego isopropanol → luego diclorometano → luego metanol.
Luego enjuague en orden inverso: metanol → diclorometano → isopropanol → hexano.
Recordatorio especial: todos los disolventes utilizados deben estar estrictamente deshidratados; no se permite ningún contenido de agua.
IV. Problemas comunes y soluciones
Contrapresión de columna anormalmente alta
Si la presión de la columna aumenta inesperadamente, las causas y acciones correspondientes generalmente son las siguientes:
frita bloqueada: Lave la columna a contracorriente o retire el extremo de la columna y sonique la frita en ácido nítrico diluido al 10 % durante 10 minutos, luego sonique en agua pura durante otros 10 minutos.
Embalaje contaminado: Reemplace el empaque contaminado en la entrada de la columna.
Precipitación de sal: Lave la columna con 10% de metanol/agua para disolver la sal cristalizada, luego continúe enjuagando con una concentración más alta de metanol.
pH inadecuado: Si la estructura de la fase estacionaria se ha dañado debido a un pH inadecuado, la recuperación suele ser imposible. La mejor práctica es prestar siempre atención al rango de pH de la columna.
De hecho, con un uso correcto y un mantenimiento adecuado, no sólo puede prolongar la vida útil de su columna, sino también garantizar resultados estables y precisos en todo momento, ahorrándole muchos desvíos experimentales.
