La cromatografía líquida de alto rendimiento es un instrumento analítico inteligente centrado en el usuario. No solo posee todas las capacidades básicas de un HPLC convencional, sino que también es compatible tanto con estaciones de trabajo de cromatografía líquida con control inverso como con estaciones de trabajo de cromatografía de uso general. Su novedosa apariencia, combinada con una mayor confiabilidad, estabilidad y facilidad de operación, lo convierte en una opción ideal para análisis de laboratorio.
Una cromatografía líquida de alta resolución consta principalmente de cinco partes principales: el sistema de inyección, el sistema de suministro de fluido, el sistema de separación, el sistema de detección y el sistema de procesamiento de datos. A continuación, explicaremos detalladamente las funciones y características de estos cinco sistemas.
I. Sistema de inyección
El sistema de inyección suele utilizar una jeringa con tabique o una válvula de inyección de alta presión para introducir la muestra, lo que garantiza un alto grado de consistencia en el volumen de inyección. Este método de inyección constante mejora significativamente la repetibilidad y precisión de los resultados analíticos, lo cual es particularmente importante para experimentos que requieren datos de alta precisión.
II. Sistema de entrega de fluidos
El sistema de suministro de fluido comprende una bomba de alta presión, un depósito de fase móvil y un dispositivo de gradiente. El rango de presión de trabajo de la bomba de alta presión suele ser de 1,47 a 4,4 × 10⁷ Pa, lo que proporciona un caudal ajustable y estable. El entorno de alta presión reduce eficazmente la difusión de la muestra en la columna y al mismo tiempo acelera la migración de la muestra a través de ella. Esto no sólo ayuda a mejorar la resolución de la separación sino que también preserva mejor la actividad biológica y la eficiencia de recuperación de la muestra. El uso combinado del depósito de fase móvil y el dispositivo de gradiente permite ajustar la fase móvil de acuerdo con las propiedades de la fase estacionaria y la muestra, incluidos los cambios en la polaridad del eluyente, la fuerza iónica, el pH y otros parámetros.
III. Sistema de separación
El sistema de separación incluye componentes clave como la columna cromatográfica, los tubos de conexión y un termostato. Las columnas suelen tener una longitud de 10 a 50 cm (se pueden conectar varias columnas en serie utilizando tubos de conexión si es necesario), con un diámetro interno de 2 a 5 mm y están hechas de acero inoxidable de alta calidad, tubos de vidrio de paredes gruesas o aleación de titanio.
La columna está rellena con una fase estacionaria de partículas de 5 a 10 μm, que consta de una matriz y un líquido estacionario. La matriz de fase estacionaria suele estar hecha de resina o gel de sílice con alta resistencia mecánica, caracterizada por buena inercia, alta porosidad y gran superficie específica. La superficie de estas matrices se puede recubrir o acoplar químicamente para unir grupos funcionales como cadenas de fosfato, amonio cuaternario, hidroximetilo, fenilo, amino o alquilo de diferentes longitudes.
Este refinado diseño de fase estacionaria ofrece una buena selectividad para sustancias con diferentes estructuras. Por ejemplo, después de acoplar la lectina de guisante (PSA) a la superficie de un gel de sílice poroso, puede separar específicamente ciertas glicoproteínas de los fibroblastos.
El pequeño tamaño de partícula de la fase estacionaria permite que el lecho empaquetado sea muy uniforme y denso, lo que reduce eficazmente la difusión en remolinos. Al mismo tiempo, los poros poco profundos y las rutas cortas de transferencia de masa ayudan a estrechar el ancho de la banda espectral y mejorar la resolución de separación. Según la teoría de placas, cuanto menor es el tamaño de las partículas de la matriz, mayor es el número teórico de placas N y mayor es la eficiencia de separación. El termostato puede ajustar la temperatura desde la temperatura ambiente hasta 60 °C, lo que acorta el tiempo de análisis al mejorar la velocidad de transferencia de masa y mejorar aún más la eficiencia de separación de la columna.
IV. Sistema de detección
En la cromatografía líquida de alta resolución se utilizan habitualmente tres tipos de detectores.:
detector ultravioleta
Adecuado para detectar muestras que absorben luz ultravioleta o visible. Sus ventajas incluyen una amplia gama de aplicaciones (se puede utilizar para proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos, nucleótidos, péptidos, hormonas y muchas otras sustancias), alta sensibilidad (límite de detección de hasta 10⁻¹⁰ g/mL), un amplio rango lineal e insensibilidad a los cambios de temperatura y caudal, lo que lo hace adecuado para la elución en gradiente.
Detector de índice de refracción
Adecuado para detectar cualquier componente de la muestra cuyo índice de refracción difiera del de la fase móvil; se utiliza especialmente para el análisis de carbohidratos. Este detector es versátil y fácil de operar, pero su sensibilidad es relativamente baja (límite de detección alrededor de 10⁻⁷ g/mL) y es sensible a los cambios en la fase móvil, por lo que no es adecuado para análisis de trazas o elución en gradiente.
Detector de fluorescencia
Específicamente adecuado para detectar compuestos orgánicos que exhiben fluorescencia, como hidrocarburos aromáticos policíclicos, aminoácidos, aminas, vitaminas y ciertas proteínas. Su mayor ventaja es una sensibilidad extremadamente alta (límite de detección tan bajo como 10⁻¹² g/mL a 10⁻¹⁴ g/mL), lo que lo hace adecuado tanto para análisis de trazas como para elución en gradiente.
V. Sistema de procesamiento de datos
El sistema de procesamiento de datos es responsable de adquirir, almacenar, mostrar, imprimir y procesar adicionalmente los datos de la prueba, asegurando que el trabajo de separación, preparación o identificación de muestras se pueda llevar a cabo de manera precisa y eficiente. Los sistemas de procesamiento de datos modernos suelen estar equipados con estaciones de trabajo de cromatografía inteligentes, que ofrecen interfaces fáciles de usar y potentes capacidades de análisis de datos, lo que mejora en gran medida la comodidad del trabajo experimental y la confiabilidad de los resultados.
Mediante el trabajo coordinado de estos cinco sistemas principales, la cromatografía líquida de alto rendimiento proporciona resultados analíticos confiables y precisos para el laboratorio, satisfaciendo una amplia variedad de necesidades analíticas complejas.
