Ya sea usted un principiante en el laboratorio o un profesional experimentado que ha trabajado con instrumentos durante años, para mantener una cromatografía líquida funcionando de manera estable y obtener datos precisos y confiables, se deben tomar en serio todos los detalles operativos. Los siguientes requisitos y especificaciones de uso se resumen de la experiencia práctica diaria; seguirlos protegerá el instrumento y le ayudará a evitar muchos desvíos.
I. Medio ambiente y preparación básica
Al igual que las personas, los instrumentos también necesitan un “entorno de trabajo” confortable. Coloque el instrumento en una mesa de trabajo estable y sin vibraciones, lejos de fuentes de calor como radiadores y hornos, y evite la luz solar directa; las fluctuaciones de temperatura y un entorno desordenado pueden afectar fácilmente los resultados analíticos. Generalmente, la temperatura ambiente debe controlarse entre 15 y 30 °C y la humedad debe cumplir con los requisitos del manual del instrumento. Limpie el banco de trabajo con regularidad para mantener el entorno ordenado y que el instrumento pueda funcionar bien.
El suministro de energía y una conexión a tierra adecuada también son esenciales. Utilice una fuente de alimentación estable; Las fluctuaciones de voltaje no solo pueden causar desviación de datos sino también dañar el instrumento. Además, una buena conexión a tierra es indispensable: no sólo evita descargas eléctricas durante el funcionamiento, sino que también evita interferencias electromagnéticas que pueden provocar inestabilidad en los datos. La seguridad y la precisión son siempre las principales prioridades.
II. Preparación de la fase móvil (disolvente)
La fase móvil es la “sangre” del cromatógrafo líquido; su calidad determina la fluidez del análisis. Los disolventes y reactivos deben ser de grado HPLC o superior. No utilice materiales de menor calidad para ahorrar costos: los datos inexactos harán perder más tiempo y esfuerzo.
La fase acuosa debe ser agua ultrapura recién preparada con una resistividad de 18,2 MΩ·cm. El agua pura almacenada durante mucho tiempo puede generar bacterias e incorporar impurezas que bloquearán los tubos y las columnas.
Antes de su uso, todas las fases móviles deben filtrarse a través de una membrana de 0,22 μm o 0,45 μm para eliminar las impurezas particuladas. De lo contrario, estas pequeñas partículas actuarán como “arena”, desgastando el cabezal de la bomba y obstruyendo la columna, lo que provocará reparaciones costosas y que llevarán mucho tiempo.
Después de la filtración, la fase móvil también debe desgasificarse, ya sea mediante sonicación o mediante un desgasificador en línea. Después de desgasificarlo, déjelo volver a temperatura ambiente antes de usarlo; de lo contrario, las diferencias de temperatura pueden hacer que se vuelvan a formar pequeñas burbujas, lo que afectará la estabilidad del bombeo.
Para las sales tampón, se deben recordar dos puntos: primero, trate de evitar las sales que precipitan fácilmente en solventes orgánicos (por ejemplo, fosfato) y mantenga la proporción orgánica no demasiado alta, de lo contrario la precipitación de sal podría bloquear el tubo. En segundo lugar, las soluciones de sal tampón deben prepararse frescas justo antes de su uso. No prepare grandes volúmenes para el almacenamiento: pueden desarrollar bacterias fácilmente, contaminando el sistema y afectando los resultados. La forma de proteger la bomba y la columna se detallará más adelante en la sección del procedimiento de limpieza.
III. Sistema de suministro de fluido y bomba
Al seleccionar una fase móvil para la bomba, primero considere la compatibilidad con el solvente. Nunca utilice disolventes orgánicos puros, como acetonitrilo puro, como fase móvil; pueden provocar que la válvula de retención se atasque fácilmente, lo que provocará que la bomba no extraiga líquido y requiera su desmontaje para su reparación. Generalmente se recomienda que la proporción acuosa no sea inferior al 5% para reducir la probabilidad de problemas en la válvula de retención.
Las burbujas son el principal enemigo de la bomba y del sistema de suministro de fluidos; hay que prevenirlos y expulsarlos a tiempo. Antes de bombear, asegúrese de que la fase móvil esté completamente desgasificada. Si se encuentran burbujas en el tubo, utilice una jeringa para aspirarlas y eliminarlas. Si la presión de la bomba es inestable y el caudal fluctúa, es probable que haya entrado aire en la bomba; realizar la operación de cebado/purga solucionará el problema.
Al cambiar las fases móviles, si las dos fases son inmiscibles (por ejemplo, al cambiar de hexano a metanol), nunca las cambie directamente. Se debe utilizar un disolvente intermedio como isopropanol para lavar el sistema; de lo contrario, las sales o sustancias fuertemente polares podrían precipitar y bloquear el tubo. Además, después de cada experimento utilizando una sal tampón, el procedimiento de limpieza debe realizarse inmediatamente. No espere hasta que el líquido se haya secado; una vez que la sal cristaliza, será mucho más difícil de eliminar.
IV. Uso y mantenimiento de la columna
La columna es el “corazón” del cromatógrafo líquido. Úselo estrictamente de acuerdo con el manual de instrucciones. En primer lugar, el rango de tolerancia del pH: la mayoría de las columnas tienen un rango de pH de 2 a 8, aunque algunas columnas especiales pueden tener un rango más amplio. Nunca inyecte muestras de ácidos o bases fuertes, especialmente muestras alcalinas con pH > 8, ya que pueden dañar rápidamente la fase estacionaria y acortar la vida útil de la columna.
La presión de funcionamiento no debe exceder la tolerancia de presión máxima de la columna y el instrumento. Si la presión aumenta repentinamente de manera anormal, no continúe; esto suele ser un signo de obstrucción. Investigue inmediatamente la causa; de lo contrario, la columna podría aplastarse.
Mantenga una temperatura constante del horno de columna. La estabilidad de la temperatura garantiza una buena repetibilidad de los resultados analíticos; de lo contrario, los datos serán inconsistentes e inutilizables.
Después de instalar una nueva columna o cambiar la fase móvil, equilibre completamente la columna con la nueva fase móvil (normalmente entre 10 y 20 volúmenes de columna) hasta que la línea base esté estable antes de comenzar el análisis; de lo contrario, los datos serán inexactos.
Si la columna no se utilizará durante un período prolongado, límpiela y guárdela según el manual de instrucciones. Las columnas de fase inversa normalmente se almacenan en metanol o acetonitrilo, las columnas de fase normal en hexano. Un punto importante: nunca almacene una columna en agua pura, ya que puede hidrolizar la fase estacionaria y promoel crecimiento bacteriano.
Además, se recomienda instalar una columna protectora delante de la columna analítica, especialmente cuando se manipulan muestras complejas. Una columna de protección atrapa la mayoría de las impurezas y prolonga la vida útil de la columna analítica; una columna analítica es costosa, por lo que cualquier ahorro vale la pena.
V. Sistema de inyección
La preparación de la muestra antes de la inyección es fundamental. La solución de muestra debe ser transparente y filtrarse a través de una membrana de 0,22 μm o 0,45 μm. Preste atención a utilizar el material de membrana correcto para la fase móvil; no los mezcle. Si la muestra contiene partículas de impurezas, obstruirán la aguja de inyección y la columna, lo que provocará la necesidad de reemplazar piezas y repetir los experimentos.
El disolvente utilizado para disolver la muestra también importa. Siempre que sea posible, utilice la fase móvil o un disolvente más débil que la fase móvil. El uso de un disolvente fuerte puede provocar el "efecto disolvente", lo que provocará formas de pico distorsionadas y afectará a los resultados cuantitativos.
Después de cada análisis de muestra, se debe limpiar minuciosamente el inyector, incluidas las paredes interior y exterior de la aguja de inyección, utilizando un disolvente que disuelva la muestra. De lo contrario, el remanente de la muestra contaminará la siguiente muestra, provocando contaminación cruzada y potencialmente arruinando el trabajo anterior.
Ciertas muestras nunca deben inyectarse directamente, como proteínas, sangre, homogeneizados de tejido y muestras que contengan partículas insolubles. Estas muestras deben tratarse previamente (por ejemplo, mediante precipitación, extracción, centrifugación y filtración de proteínas) antes de la inyección. De lo contrario, causarán graves daños al instrumento.
VI. Detector
La celda de flujo del detector es un componente clave para garantizar datos precisos; debe mantenerse limpio. Muchas veces, la inestabilidad de la línea base o los datos inexactos son causados por una celda de flujo contaminada, ya sea por precipitación de sal tampón o residuos de muestra. Por lo tanto, después de cada uso, la celda de flujo debe limpiarse según el procedimiento prescrito.
Para los detectores que utilizan una lámpara (por ejemplo, detectores UV), preste atención a extender la vida útil de la lámpara. No encienda y apague la lámpara innecesariamente. Cuando el instrumento no esté en uso, apague la lámpara siguiendo el procedimiento. Los cambios frecuentes acortan la vida útil de la lámpara; reemplazar una lámpara es costoso, por lo que cualquier ahorro es bienvenido.
VII. Limpieza y apagado del sistema
Después de un experimento en el que se utiliza una fase móvil que contiene tampón, no se deben omitir los pasos de limpieza. Realice el siguiente procedimiento inmediatamente: primero, lave el tubo y la columna con agua desionizada (o entre un 5 y un 10 % de metanol/agua) a un caudal bajo durante al menos 30 a 60 minutos para eliminar completamente los residuos de sal. Luego enjuague con metanol o acetonitrilo a un caudal mayor durante más de 40 minutos para desplazar la fase acuosa y eliminar los residuos orgánicos. Si la limpieza no es exhaustiva, la sal cristalizará en el tubo y provocará obstrucciones la próxima vez que se inicie el sistema, lo que dificultará aún más la limpieza.
Para el apagado: primero reduzca el caudal del sistema a cero, luego apague la lámpara del detector, luego apague la bomba y el software y finalmente desconecte la alimentación. No te apresures; Sigue la secuencia paso a paso. Esto protege los distintos componentes y prolonga la vida útil general del instrumento.
VIII. Prevención de fallas y solución de problemas
El mantenimiento preventivo regular puede reducir en gran medida la aparición de fallas.
Si la presión es demasiado alta (probablemente un bloqueo): Verifique y limpie en el siguiente orden: primero la columna de protección: reemplácela o límpiela según sea necesario; luego el filtro en línea del mezclador: retírelo y límpielo; luego el filtro del tubo – inspeccionarlo y limpiarlo; finalmente, las válvulas de retención de la bomba; si están obstruidas, lávelas con isopropanol o soníquelas con isopropanol; si está obstruido con material inorgánico, también se puede utilizar ácido nítrico diluido al 10%.
Si la presión es demasiado baja o cero: En primer lugar, compruebe si se ha agotado la fase móvil y si hay fugas en algún racor de tubo. Si ambos están bien, es posible que haya una gran cantidad de aire en la bomba; realizar el procedimiento de cebado/purga solucionará el problema.
Si la línea de base es ruidosa o está a la deriva: Primero verifique si la fase móvil está fresca y completamente desgasificada; luego verifique si la energía de la lámpara del detector es suficiente y si la lámpara está cerca del final de su vida útil; luego verifique si la temperatura del horno de columna es estable; finalmente verifique si la celda de flujo está contaminada; de ser así, límpiela rápidamente.
De hecho, si sigue los requisitos y especificaciones anteriores, el cromatógrafo líquido permanecerá en óptimas condiciones de funcionamiento, los datos obtenidos serán fiables y la vida útil tanto del instrumento como de las columnas se ampliará significativamente, ahorrando preocupaciones y dinero.
