Los cromatógrafos líquidos se dividen principalmente en dos tipos según la fase estacionaria: cromatografía líquido-líquido (LLC) y cromatografía líquido-sólido (LSC). Los sistemas de cromatografía líquida que se utilizan habitualmente en la actualidad suelen incluir componentes clave como una bomba de alta presión, un dispositivo de inyección, un sistema de control de temperatura, una columna, un detector y un sistema de registro de señales. En comparación con los equipos tradicionales de cromatografía en columna líquida, los sistemas modernos ofrecen claras ventajas en cuanto a velocidad de análisis, eficiencia de separación y sensibilidad de detección, lo que ayuda al personal de laboratorio a completar el trabajo analítico de manera más eficiente.
En el análisis de cromatografía líquida, la limpieza diaria y el almacenamiento adecuado de la columna son particularmente críticos, ya que afectan directamente el rendimiento estable de la columna. Por lo tanto, estos dos aspectos deben manejarse con cuidado.
I. Limpieza del cromatógrafo líquido y columnas
Después de cada análisis de muestra, la columna debe limpiarse rápidamente; de lo contrario, los residuos de la muestra o las impurezas se acumularán en la columna, afectando su rendimiento con el tiempo. El método de limpieza específico depende del modo cromatográfico utilizado y de la composición de la fase móvil; no existe un enfoque único que sirva para todos.
Métodos de limpieza para diferentes modos cromatográficos.
Columnas de fase invertida: En la cromatografía de fase reversa, los componentes más polares eluyen primero, dejando sustancias menos polares en la columna. En este caso, la columna se debe lavar con un disolvente de elución fuerte, como metanol al 100 %, isopropanol o tetrahidrofurano (THF). Generalmente es suficiente lavar con aproximadamente 20 volúmenes de columna de dicho disolvente para eliminar las sustancias residuales.
Limpieza después de utilizar fases móviles que contienen tampón: Si se utilizó una sal tampón en la fase móvil, la columna debe lavarse minuciosamente con agua destilada antes de cambiar a un disolvente orgánico; este paso no se puede omitir. Saltarlo puede causar que los cristales de sal precipiten y obstruyan la columna o la ruta de flujo del sistema, haciendo que la limpieza posterior sea muy problemática. Después de enjuagar con agua destilada, continúe enjuagando con un solvente apropiado.
columnas de gel: Las columnas de filtración en gel utilizan principalmente soluciones tampón como fase móvil. Después de cada uso, enjuague la columna con agua destilada lo antes posible. Si la columna se va a utilizar de forma continua y planea dejarla durante la noche, puede almacenar la columna con una solución tampón, pero mantenga el caudal bajo para evitar la precipitación de sal. Nota especial: si la fase móvil contiene componentes corrosivos como haluros, incluso si se almacena solo durante la noche, la columna debe lavarse minuciosamente con agua destilada para evitar la corrosión de la columna y del sistema.
Problemas comunes de limpieza y soluciones.
Problema 1: La contrapresión de la columna permanece alta después de la limpieza
Esto suele deberse a impurezas residuales difíciles de eluir o a pequeñas partículas que bloquean el lecho. Intente aumentar la concentración del disolvente de elución (p. ej., para columnas de fase reversa, reemplace el metanol con isopropanol), extienda el tiempo de lavado o enjuague a un caudal bajo (0,2‑0,3 ml/min) durante 30 a 60 minutos para permitir que el disolvente entre en contacto mejor con las impurezas. Si la obstrucción es causada por partículas, desconecte el detector y lave la columna con disolvente filtrado (consulte el manual de la columna para confirmar si se permite el retrolavado) para ayudar a desalojar las partículas.
Problema 2: Ampliación de picos o resolución disminuida después de la limpieza
Esto puede deberse a un cambio repentino en la composición del disolvente que hace que la fase estacionaria se encoja o se dañe. Por ejemplo, cambiar directamente de una fase muy acuosa a un disolvente orgánico puro puede provocar que la fase estacionaria en una columna de fase inversa se deshidrate y se contraiga. La solución es aumentar la proporción de disolvente orgánico gradualmente (incrementos de 10% a 20%) durante la siguiente limpieza para permitir que la fase estacionaria se adapte. Si el cambio de forma del pico es significativo, intente lavar a un caudal bajo con una fase móvil de baja potencia (p. ej., 5 % de metanol-agua) para ayudar a que la fase estacionaria se recupere lentamente.
Problema 3: Aparecen cristales blancos dentro de la columna debido a los residuos de sal tampón.
Este es un problema típico causado por cambiar a un solvente orgánico sin eliminar completamente la sal. Una vez que aparecen los cristales, desconecte el detector y enjuague la columna lentamente con agua destilada a un caudal bajo (0,1-0,2 ml/min) para disolver los cristales gradualmente (no utilice un caudal alto, ya que puede rayar el lecho). El tiempo de lavado depende de la cantidad de cristales, normalmente de 1 a 2 horas, hasta que la contrapresión vuelva a la normalidad. Luego limpie la columna según el procedimiento estándar.
II. Almacenamiento de cromatógrafo líquido y columnas
Cuando la columna no se utiliza durante un tiempo, las condiciones de almacenamiento afectan directamente su vida útil y su estabilidad de rendimiento, por lo que el almacenamiento también debe realizarse con cuidado.
Métodos de almacenamiento para diferentes duraciones.
Almacenamiento a corto plazo (unos días)
Después de la limpieza de rutina, apriete los extremos de la columna con los tapones sellados adecuados. Asegúrese de utilizar enchufes que coincidan; de lo contrario, un sellado deficiente permitirá la entrada de aire y la evaporación del disolvente. Luego almacene la columna a temperatura ambiente en un ambiente limpio, evitando fuentes de calor o luz solar directa.
Almacenamiento a largo plazo (más de unas pocas semanas)
Si el período de almacenamiento excede algunas semanas, simplemente sellar los extremos no es suficiente para mantener la eficiencia de la columna. En este caso, llene la columna con un disolvente de almacenamiento adecuado recomendado en el manual de la columna.
Columnas de fase invertida: Generalmente se recomienda el metanol como disolvente de almacenamiento; mantiene húmeda la fase estacionaria e inhibe el crecimiento microbiano.
Columnas de fase normal: Se pueden utilizar disolventes orgánicos como hexano o heptano para evitar que la fase estacionaria absorba humedad.
columnas de gel: No lo almacene en agua pura, ya que esto puede promoprovocar el crecimiento microbiano y afectar el rendimiento de la columna. Se recomienda lavar la columna con una solución de azida sódica (NaN₃) al 0,05 % antes de sellarla y almacenarla. La azida de sodio inhibe eficazmente el crecimiento microbiano, pero se deben tomar medidas de protección durante la manipulación para evitar el contacto con la piel.
Independientemente del tipo de columna, antes del almacenamiento a largo plazo, asegúrese de que la columna esté llena con el disolvente de almacenamiento adecuado y de que ambos extremos estén bien sellados. Si el disolvente se evapora, la fase estacionaria puede secarse y encogerse, lo que provoca una pérdida significativa de eficiencia de la columna o incluso daños permanentes, una consecuencia costosa.
Problemas comunes de almacenamiento y soluciones.
Problema 1: Aparecen burbujas dentro de la columna después de un almacenamiento a corto plazo.
Esto suele deberse a tapones de sellado flojos que permiten la entrada de aire. Conecte la columna al sistema, enjuague con el disolvente de almacenamiento (p. ej., metanol para columnas de fase reversa) a un caudal bajo (0,2‑0,3 ml/min) para expulsar las burbujas. Después de enjuagar durante 10 a 15 minutos, desconecte la columna y vuelva a apretar los tapones. Antes del siguiente almacenamiento, comprobar que los tapones estén intactos y apretarlos con fuerza moderada para evitar dañar los extremos de la columna.
Problema 2: Aparece material floculante (crecimiento microbiano) dentro de una columna de gel después de un almacenamiento prolongado
Esto ocurre porque el disolvente de almacenamiento carecía de agente antimicrobiano o la concentración era insuficiente. Primero, deseche el disolvente viejo, enjuague la columna con agua destilada durante 1 hora, luego enjuague con una solución de azida sódica al 0,1% a un caudal bajo durante 30 minutos para matar los microbios. Luego llene la columna con una solución nueva de azida sódica al 0,05% y vuelva a sellarla. Si hay una gran cantidad de material floculante, es posible que la columna ya esté dañada; probar su desempeño con un estándar. Si la eficiencia ha disminuido más del 30%, es poco probable que la columna funcione correctamente.
Problema 3: Pérdida significativa de resolución en una columna de fase normal después de un almacenamiento prolongado
Es probable que esto se deba a que la fase estacionaria absorbe humedad de un entorno de almacenamiento con alta humedad. Conecte la columna al sistema y enjuague con una mezcla de hexano-isopropanol (95:5) a un caudal bajo durante 30 minutos para eliminar la humedad. Luego reemplácelo con hexano puro, selle la columna y guárdela en un ambiente seco (es aconsejable agregar una pequeña cantidad de desecante). Para almacenamiento futuro, es mejor mantener las columnas de fase normal en un desecador sellado para evitar la absorción de humedad.
En resumen, limpiar y almacenar las columnas según procedimientos estándar no solo prolonga su vida útil sino que también garantiza la repetibilidad y precisión de los resultados analíticos, un aspecto crucial de la gestión de calidad en los experimentos de cromatografía líquida.
