Los neurotransmisores son mensajeros químicos que transmiten señales a través de sinapsis y desempeñan funciones esenciales en la regulación de la función cerebral, el estado de ánimo, la cognición y el comportamiento. Los desequilibrios en los niveles de neurotransmisores están implicados en diversos trastornos neurológicos y psiquiátricos, como la depresión, la ansiedad, la esquizofrenia, la enfermedad de Parkinson y la epilepsia. Entre los neurotransmisores más críticos se encuentran el ácido γ-aminobutírico (GABA) y la norepinefrina, que modula las respuestas de atención, excitación y estrés. La medición precisa de estos compuestos en muestras biológicas (p. ej., suero, líquido cefalorraquídeo, tejido cerebral) es crucial para comprender los mecanismos de la enfermedad, diagnosticar trastornos y monitorear las intervenciones terapéuticas. Este artículo presenta métodos de HPLC validados que utilizan el sistema EClassical 3200L UHPLC para la determinación de GABA y norepinefrina, cada uno optimizado para las propiedades fisicoquímicas específicas del analito.
Estándares
Estándares de GABA y noradrenalina (grado analítico, ≥98%)
reactivos
Acetonitrilo (grado HPLC), metanol (grado HPLC), trietilamina (grado analítico), isotiocianato de fenilo (PITC) (grado analítico), acetato de sodio trihidrato (grado analítico), ácido acético (glacial, grado analítico), ácido cítrico (grado analítico), hidrogenofosfato disódico (grado analítico), heptanosulfonato de sodio (reactivo de par iónico), agua desionizada (≥18,2) MΩ·cm)
Preparación de solución estándar
Soluciones madre individuales (1,0 mg/ml) : Pesar con precisión 10,0 mg de cada estándar en matraces volumétricos de 10 ml separados. Disolver GABA en agua, dopamina y norepinefrina en HCl 0,1 mol/L o fase móvil. Diluir a volumen y conservar a 4°C protegido de la luz.
Soluciones estándar de trabajo: Diluya cada solución madre con la fase móvil adecuada para obtener una serie de concentraciones de calibración (p. ej., 0,1–100 μg/ml según el analito y la aplicación).
Reactivos de derivatización (para GABA): 1,0 mol/L de trietilamina en acetonitrilo y 0,2 mol/L de PITC en acetonitrilo (requerido para la detección UV de GABA).
La preparación de la muestra varía según el analito y la matriz. Los procedimientos generales incluyen:
Para GABA (requiere derivatización) :
Para noradrenalina:
Filtrar a través de una membrana de 0,22 μm antes de la inyección.
Sistema HPLC
Sistema EClassical 3200L UHPLC que consta de bomba binaria de alta presión P3220L, muestreador automático S3220L, D3210L UV-Vis Detector, horno de columna O3220L, bandeja para botellas de disolvente T3200L, estación de datos de cromatografía Kromstation
Para GABA
columnas: Columna dedicada para análisis de aminoácidos Elite APP (5 μm, 4,6 × 250 mm)
Fase móvil: Acetonitrilo/metanol/agua = 60/20/20 (v/v/v)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 254 nm (después de la derivatización PITC)
Volumen de inyección: 10 μL
Temperatura de la columna: 40°C
Para noradrenalina:
columnas: Supersil ODS2 (5 µm, 4,6 × 250 mm)
Fase móvil: Solución de metanol/acetonitrilo/heptanosulfonato de sodio = 10/10/90 (v/v/v)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 280 nm
Volumen de inyección: 20 µL
Temperatura de la columna . : 30°C
Análisis GABA
Un cromatograma representativo del estándar GABA derivatizado (Figura 1) muestra un pico bien resuelto con buena simetría. Utilizando la columna de análisis de aminoácidos Elite APP, el GABA eluye en un tiempo razonable, separándose de otros aminoácidos y componentes de la matriz. El método demuestra una alta sensibilidad y repetibilidad, adecuado para cuantificar GABA en muestras biológicas como suero o líquido cefalorraquídeo.
Figura 1. Cromatograma de GABA en una muestra de suero derivatizado
Análisis de noradrenalina
La cromatografía de pares iónicos en la columna Supersil ODS2 proporciona una retención y separación efectivas de la norepinefrina de las interferencias polares. Un cromatograma típico (Figura 2) muestra un pico bien definido. El método logra una buena linealidad y precisión, lo que lo hace adecuado para analizar norepinefrina en plasma, orina o homogeneizados de tejido.
Figura 2. Cromatograma del estándar de norepinefrina
Los métodos exhiben forma de pico, resolución y sensibilidad satisfactorias. El sistema EClassical 3200L UHPLC, con su capacidad de alta presión y control de flujo preciso, admite aplicaciones tanto convencionales como de rendimiento ultraalto, lo que permite el desarrollo de métodos flexibles para el análisis de neurotransmisores.
