El ácido glutámico es un aminoácido ácido abundantemente presente en las proteínas de los cereales y en el tejido cerebral animal. Es uno de los aminoácidos constituyentes de las proteínas y desempeña importantes funciones fisiológicas en el cuerpo humano. Clínicamente, se utiliza en el tratamiento de la encefalopatía hepática y ciertos trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia y la epilepsia del pequeño mal. El ácido glutámico también contribuye a la función cognitiva manteniendo la neurotransmisión excitadora en el cerebro y es ampliamente conocido como potenciador del sabor (glutamato monosódico). Monitorear los niveles de ácido glutámico en suero es importante para estudiar trastornos neurológicos y funciones metabólicas. Este artículo presenta un método de HPLC utilizando el sistema EClassical 3200L UHPLC con derivatización precolumna para la determinación de ácido glutámico en suero humano.
Estándares
Estándar de ácido glutámico (grado analítico, ≥99%)
reactivos
Metanol (grado HPLC), Acetonitrilo (grado HPLC), Trietilamina (grado analítico), Isotiocianato de fenilo (PITC) (grado analítico), Acetato de sodio trihidrato (grado analítico), Ácido acético (glacial, grado analítico), Agua desionizada (≥18,2 MΩ·cm), Tampón de acetato de sodio (0,05 mol/L, pH ajustado a 6,5 con ácido acético).
Preparación de solución estándar
Solución madre de ácido glutámico (1,0 mg/ml): Pesar con precisión 10,0 mg de estándar de ácido glutámico en un matraz aforado de 10 ml, disolverlos en agua y diluir a volumen. Conservar a 4°C.
Soluciones estándar de trabajo: Diluya la solución madre con agua para obtener una serie de concentraciones (p. ej., 5, 10, 20, 50, 100 μg/ml) para la calibración.
Reactivos de derivatización
1,0 mol/L de trietilamina en acetonitrilo, 0,2 mol/L de PITC en acetonitrilo
Sistema HPLC
Sistema EClassical 3200L UHPLC que consta de bomba binaria de alta presión P3220L, muestreador automático S3220L, D3210L UV-Vis Detector, horno de columna O3220L, bandeja para botellas de disolvente T3200L y estación de datos de cromatografía Kromstation.
Columna: Columna dedicada para análisis de aminoácidos Elite APP (5 μm, 4,6 × 250 mm)
Fase móvil: A: 0,025 mol/l de acetato de sodio (pH 6,5); B: acetonitrilo/metanol/agua = 60/20/20 (v/v/v), en gradiente.
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 254 nm
Volumen de inyección: 10 µL
Temperatura de la columna . : 40°C
Cromatograma estándar
La Figura 1 muestra un cromatograma del estándar de ácido glutámico en las condiciones cromatográficas.
Figura 1. Cromatograma del estándar de ácido glutámico (pico 1)
Análisis de muestras
El ácido glutámico se separó bien de una muestra biológica real, como el suero sanguíneo. En la Figura 2 se muestra un cromatograma típico de una muestra de suero derivatizado. Los parámetros cromatográficos se resumen en la Tabla 1.
Figura 2. Cromatograma de ácido glutámico en una muestra de suero derivatizado (pico 1)
Tabla 1. Parámetros cromatográficos del ácido glutámico en muestra de suero
| Cima | Compuesto | Tiempo de retención (min) | Área de pico (mV·s) | Número de placa (N) | Factor de cola | Resolución |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | ácido glutámico | 7.08 | 270.50 | 17100 | 1.11 | 5.49 |
Los resultados demuestran una excelente simetría de picos (factor de cola = 1,11), una alta eficiencia de la columna (número de placas = 17.100) y una separación inicial de los picos adyacentes (resolución = 5,49). El método es adecuado para el análisis cuantitativo de ácido glutámico en suero humano.
El método de HPLC descrito que utiliza el sistema EClassical 3200L UHPLC con derivatización previa a la columna proporciona un medio confiable y sensible para determinar los niveles de ácido glutámico en suero humano. Ofrece buena resolución, alta eficiencia de columna y resultados reproducibles, lo que lo hace aplicable para investigación clínica y fines de diagnóstico relacionados con trastornos neurológicos y metabólicos.
