El benzo(a)pireno (BaP) es un hidrocarburo aromático policíclico representativo y un potente carcinógeno. Es el único HAP específicamente regulado en agua potable (GB 5749-2006, límite 0,01 μg/L) y agua de mar (GB 3097-1997, límite 0,0025 μg/L). Los métodos tradicionales de extracción líquido-líquido (LLE) requieren mucho tiempo y mano de obra. Una extracción en fase sólida (SPE) en línea junto con HPLC y detección de fluorescencia ofrece una alternativa rápida, automatizada y altamente sensible. Este capítulo presenta un método SPE-HPLC en línea para la determinación de BaP en agua, que proporciona una sensibilidad y simplicidad superiores.
Estándares
Benzo(a)pireno
reactivos
Metanol (grado HPLC), Benceno (grado analítico), Ciclohexano (grado HPLC). Agua Desionizada (18,2 MΩ·cm).
Otros materiales
Filtros de membrana PDVF (0,45 μm), columna protectora C18 (utilizada como cartucho SPE), etc.
Preparación de solución estándar
Solución madre (100 μg/ml) : Pesar con precisión 5,00 mg de BaP, disolverlos en una pequeña cantidad de benceno y diluir a 50 ml con ciclohexano. Transferir a una botella de color ámbar y almacenar a 4°C (estable durante 6 meses).
Solución intermedia (1 μg/ml): Pipetear 1,00 ml de solución madre en un matraz volumétrico de color ámbar de 100 ml y diluir a volumen con ciclohexano. Conservar a 4°C (estable durante 1 mes).
Soluciones de trabajo para la calibración. : Prepare muestras de agua enriquecidas diluyendo la solución intermedia con agua para obtener concentraciones de 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05 y 0,1 μg/L. Se utilizan directamente para el análisis SPE-HPLC en línea.
La muestra filtrada está lista para inyectarse en el sistema SPE-HPLC en línea, donde se cargará en un cartucho SPE C18 para su enriquecimiento y posterior elución en la columna analítica.
Sistema SPE-HPLC en línea ($EClassical 3100)
Dos bombas de alta presión P1100 para suministro de fase móvil (bombas A y B), una bomba P1100 adicional para carga de muestras (bomba C), detector de fluorescencia, horno de columna O1100, válvula de conmutación de seis puertos y dos posiciones con actuador eléctrico, muestreador automático S3100, desgasificador DG3100, estación de datos de cromatografía
SinoPak C18 columna analítica (5 μm, 4,6 × 250 mm), columna de protección C18 (utilizada como cartucho SPE, por ejemplo, columna de protección JieJie C18),
Equipo adicional
Aparato de filtración de disolventes (1000 mL), Bomba de vacío (GM-0.33A, 0,08 MPa, 160 W), Limpiador ultrasónico (AS3120, 40/60 kHz, 120 W), Balanza analítica (precisión de 0,0001 g)
Columna analítica: SinoPak C18 (5 µm, 4,6 × 250 mm)
Fase móvil: R: Metanol; B: agua
Caudal: Ver la tabla de gradientes a continuación
Detección: Fluorescencia, excitación a 290 nm, emisión a 430 nm
Temperatura de la columna: 30°C
cartucho SPE: C18 (p. ej., columna de protección JieJie C18)
Secuencia SPE en línea :
| Tiempo (minutos) | Bomba A (ml/min) | Bomba B (ml/min) | Bomba C (ml/min) | Posición de la válvula | Descripción |
|---|---|---|---|---|---|
| 0–1 | 0.5 | 0.5 | 4 | Inyectar | Carga de muestra en cartucho SPE |
| 1–2 | 0.5 | 0.5 | 4 | Inyectar | Continuar cargando |
| 2–7 | 0.9 | 0.1 | 0 | Carga | Lavado de cartuchos SPE |
| 7–32 | 0.9 | 0.1 | 0 | Inyectar | Elución y separación. |
Figura 1. Diagrama de proceso de flujo de SPE-HPLC en línea
Cromatograma típico
En las condiciones optimizadas de SPE-HPLC en línea, se analizó una solución estándar de BaP a 0,01 μg/l. El cromatograma (Figura 1) muestra un pico nítido y bien resuelto con un tiempo de retención de aproximadamente 14 min.
Figura 1. Cromatograma típico del estándar de benzo(a)pireno (0,01 μg/L) mediante SPE-HPLC en línea
Curva de calibración
Se analizaron muestras de agua enriquecidas con BaP en concentraciones de 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05 y 0,1 μg/L. La curva de calibración (Figura 2) se construyó trazando el área del pico frente a la concentración. La ecuación de regresión lineal es:
y= 51617x + 76,328, R = 0,9994
donde y es el área del pico y x es la concentración en μg/L. El método muestra una linealidad excelente en el rango de 0,001 – 0,1 μg/L.
Figura 2. Curva de calibración para benzo(a)pireno en agua mediante SPE-HPLC en línea
Límites de detección y cuantificación
Basado en una relación señal-ruido de 3 para el límite de detección y 10 para el límite de cuantificación, los límites de detección y cuantificación del instrumento se dan en la Tabla 1. El método es mucho más sensible que los límites reglamentarios (agua potable, 0,01 μg/L; agua de mar, 0,0025 μg/L).
Tabla 1. Límites de detección y cuantificación del benzo(a)pireno
| Parámetro | Valor (μg/L) |
|---|---|
| Límite de detección del instrumento (S/N=3) | 5×10−6 |
| Límite de cuantificación del instrumento (S/N=10) | 3×10−5 |
Recuperación y Precisión
La recuperación se evaluó añadiendo muestras de agua en blanco a tres niveles de concentración (0,001, 0,0025 y 0,01 μg/L). Cada nivel fue analizado con múltiples réplicas. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Las recuperaciones oscilaron entre 80,35 % y 105,08 % y la desviación estándar relativa (RSD) en el nivel de 0,0025 μg/l (n=8) fue de 3,34 %, lo que demuestra buena exactitud y precisión.
Tabla 2. Resultados de recuperación de picos para benzo(a)pireno
| Nivel de pico (μg/L) | Recuperación media (%) | RSD (%) | Número de réplicas (n) |
|---|---|---|---|
| 0.001 | 99.7 | 4.2 | 3 |
| 0.0025 | 83.8 | 3.34 | 8 |
| 0.01 | 100.1 | 2.1 | 3 |
El método SPE-HPLC en línea con detección de fluorescencia proporciona una solución totalmente automatizada, rápida y altamente sensible para el análisis de trazas de benzo(a)pireno en agua. Alcanza límites de detección tan bajos como 5×10 −6 μg/L, que está muy por debajo de los límites reglamentarios para agua potable y de mar. El método ofrece linealidad, exactitud y precisión excelentes, lo que lo hace ideal para monitoreo de rutina y pruebas de cumplimiento.
