Determinación de aminoácidos en piensos mediante HPLC de derivatización previa a la columna (método AAP)

• analito: 17 aminoácidos (Asp, Glu, Ser, Gly, His, Arg, Thr, Ala, Pro, Tyr, Val, Met, Cys, Ile, Leu, Phe, Lys)
• Sistema: EClassical 3100 HPLC Sistema con Detector UV
• Columna: Columna de análisis de aminoácidos EliteAAP (5 μm, 4,6 × 250 mm)
• Destacar: Método HPLC de derivatización precolumna PITC para la determinación simultánea de 17 aminoácidos en piensos con excelente linealidad, repetibilidad y estabilidad

Los aminoácidos son las unidades fundamentales de las proteínas y nutrientes esenciales para el crecimiento animal. Su composición y contenido son indicadores críticos de la calidad de la proteína del alimento. Sin embargo, debido a la gran cantidad de aminoácidos, sus estructuras similares y la falta de una fuerte absorción de rayos UV o fluorescencia para la mayoría de ellos, el análisis de aminoácidos siempre ha sido un desafío en HPLC. Para abordar esto, Elite (Dalian) Analytical Instruments Co., Ltd. ha desarrollado una solución completa para el análisis HPLC de derivatización previa a la columna de aminoácidos utilizando isotiocianato de fenilo (PITC) como reactivo de derivatización. El proceso de derivatización es simple y rápido y produce derivados estables (hasta 3 días) con alta sensibilidad, precisión y bajo costo, lo que lo hace adecuado para el análisis de aminoácidos de rutina en los alimentos. El sistema Elite-AAP emplea una columna C18 dedicada para lograr la separación inicial de 17 aminoácidos con detección UV a 254 nm.

Estándares de aminoácidos: 17 aminoácidos (Asp, Glu, Ser, Gly, His, Arg, Thr, Ala, Pro, Tyr, Val, Met, Cys, Ile, Leu, Phe, Lys), pureza ≥98%

Reactivos de derivatización: 1,0 mol/L de trietilamina en acetonitrilo, 0,2 mol/L de isotiocianato de fenilo (PITC) en acetonitrilo

Componentes de fase móvil: fase móvil A: Acetonitrilo/Metanol/Agua = 60:20:20 (v/v/v); Fase móvil B: preparada a partir de componentes sólidos (proporcionados en el kit de aminoácidos), disuelta en agua, ajustada a pH 6,5. ±0,05 con ácido acético glacial y diluir a volumen. Filtrar a través de una membrana de 0,45 μm y desgasificar antes de usar.

Otros reactivos: Ácido clorhídrico (6 mol/L, grado analítico), ácido perfórmico (recién preparado, para la oxidación de aminoácidos que contienen azufre si es necesario), n-hexano (grado analítico), acetato de sodio (para solución de acetato de sodio de 0,05 mol/L), ácido acético glacial (para ajustar el pH), acetonitrilo, metanol (grado HPLC), agua desionizada (18,2 MΩ·cm)

Soluciones madre de aminoácidos: Pese con precisión cantidades adecuadas de cada estándar de aminoácido y disuélvalas en HCl de 0,1 mol/l para preparar soluciones madre individuales en concentraciones de aproximadamente 2,5 μmol/ml. Mezcle volúmenes apropiados para obtener una solución madre de aminoácidos mixtos.

Soluciones estándar de trabajo: Diluya la solución madre mixta con 0,1 mol/L de HCl para obtener una serie de concentraciones que cubran el rango de 0,025 a 1,0 μmol/mL (p. ej., 0,025, 0,25 y 1,0 μmol/mL). Tome 200 μL de cada estándar de trabajo para la derivatización siguiendo el mismo procedimiento que para las muestras.

• Oxidación (si se requiere la determinación de aminoácidos que contienen azufre): Pese una cantidad adecuada de muestra de alimento (equivalente a aproximadamente 25 mg de proteína) en una ampolla de 5 ml. Agregue 300 l de ácido perfórmico enfriado y recién preparado, selle con parafilm y colóquelo en un baño de hielo a 4 ° C durante 16 h. Deje que la muestra vuelva a temperatura ambiente y se evapore hasta sequedad bajo una suave corriente de nitrógeno.
• Hidrólisis: Añadir 3 ml de HCl de 6 mol/L a la ampolla, sellar la ampolla con llama y colocar en un horno a 110 ± 3 °C durante 24 h. Después de la hidrólisis, se enfría a temperatura ambiente, se abre la ampolla y se evapora el contenido hasta sequedad en atmósfera de nitrógeno.
• Disolución y dilución: Lavar la ampolla repetidamente con pequeñas porciones de agua y transferir los lavados combinados a un matraz volumétrico de 25 mL. Diluir a volumen con agua y mezclar bien. Filtrar una alícuota a través de un filtro de membrana de 0,45 μm.
• Derivatización: Pipetee 200 μL de la solución de muestra filtrada en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml. Añadir 100 l de trietilamina de 1,0 mol/l en acetonitrilo y 100 l de PITC de 0,2 mol/l en acetonitrilo. Vortex durante 10 s y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 h.

Opción A (para muestras con alto contenido de aminoácidos): Añadir 0,6 ml de n-hexano, agitar durante 1 min y dejar reposar durante 10 min. Deseche la capa superior de hexano. Diluir la capa inferior 4 veces con una solución de acetato de sodio de 0,05 mol/l.

Opción B (para muestras con bajo contenido de aminoácidos): Después de la derivatización, se evapora la mezcla hasta sequedad en atmósfera de nitrógeno. Redisolver el residuo en 400 l (o tan solo 100 l para mayor sensibilidad) de solución de acetato de sodio de 0,05 mol/l y agitar.

• Filtrar la solución derivatizada a través de un filtro de membrana de 0,45 μm antes de la inyección de HPLC (10 μL).

Sistema HPLC : EClassical 3200 equipado con bomba de alta presión P3200, D3210 UV-Vis Detector, muestreador automático S3210, O3220 Column Oven, bandeja para botellas de solvente T3200, Kromstation CDS.

Equipos de pretratamiento: Baño ultrasónico, aparato de filtración de disolventes, evaporador de nitrógeno, mezclador vórtex, pipetas (200 μL, 1 mL), estufa de secado (temperatura >120°C), ampollas de 5 mL, película selladora, filtros de membrana de 0,45 μm (orgánicos y acuosos), filtros de jeringa, etc.

• Columna: Columna de análisis de aminoácidos EliteAAP (5 μm, 4,6 × 250 mm)
• Fase Móvil: A: Acetonitrilo/Metanol/Agua = 60: 20: 20 (v/v/v), desgasificado por sonicación durante 10 a 15 min.
• B: Preparado a partir de componentes sólidos (ver "Fase móvil B" más arriba), filtrado a través de una membrana de 0,45 μm y desgasificado
• Tasa de flujo: 1,0 ml/min
• Detección: UV a 254 nm
• Inyección vol.: 20 µL
• Temperatura de la columna.: 42ºC

En la Figura 1 se muestra un cromatograma típico de los estándares de 17 aminoácidos obtenidos en las condiciones descritas. Los 17 aminoácidos están bien resueltos y cumplen con los requisitos para el análisis cualitativo y cuantitativo.

Fig. 1. Cromatograma de los estándares de 17 aminoácidos.

Picos: 1-Asp, 2-Glu, 3-Ser, 4-Gly, 5-His, 6-Arg, 7-Thr, 8-Ala,

9-Pro, 10-Tyr, 11-Val, 12-Met, 13-Cys, 14-Ile, 15-Leu, 16-Phe, 17-Lys.

Linealidad

Las curvas de calibración se construyeron utilizando soluciones estándar de trabajo en concentraciones de 0,025, 0,25 y 1,0 μmol/ml (y puntos intermedios adicionales). Las ecuaciones de regresión lineal y los coeficientes de correlación para cada aminoácido se resumen en la Tabla 1. Todos los coeficientes de correlación (R) son superiores a 0,9994, lo que indica una linealidad excelente en el rango probado.

Tabla 1. Ecuaciones lineales y coeficientes de correlación para 17 aminoácidos

Límite de detección

Se encontró que la concentración más baja detectable de ácido aspártico (Asp) era 3,13×10⁻⁶ mol/L. Se esperan límites de detección similares para otros aminoácidos en las mismas condiciones.

Repetibilidad

La repetibilidad del método se evaluó analizando cinco muestras replicadas en tres niveles de concentración (0,025, 0,25 y 1,0 μmol/ml). Las desviaciones estándar relativas (RSD%) de las áreas de los picos para los 17 aminoácidos se resumen a continuación: a 0,025 μmol/mL, la RSD osciló entre 1,96% y 4,90%; a 0,25 µmol/ml, la RSD osciló entre 1,00 % y 1,99 %; a 1,0 μmol/ml, la RSD osciló entre 0,87% y 1,76%. Estos resultados demuestran una excelente repetibilidad, especialmente a concentraciones más altas.

Exactitud

La precisión se evaluó mediante experimentos de adición a una concentración de 0,25 µmol/ml (n=5). Las tasas de recuperación para los 17 aminoácidos oscilaron entre 87,32% (Thr) y 118,48% (Asp). Los datos completos de recuperación se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Ecuaciones lineales y coeficientes de correlación para 17 aminoácidos

Estabilidad derivada

La estabilidad de los aminoácidos derivatizados con PITC se evaluó analizando la misma muestra durante tres días consecutivos (tres inyecciones por día, n=9). El % de RSD de las áreas de pico para todos los aminoácidos estuvo por debajo del 2 % excepto para la cisteína (Cys), que mostró una RSD del 6,63 %. Los resultados confirman que los derivados son estables durante al menos tres días en las condiciones descritas.