Determinación de aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂ en alimentos y cereales

• analito: Aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂
• Sistema: Sistema HPLC Agress 1100 o iChrom 5100 con detector de fluorescencia y derivatizador fotoquímico poscolumna
• Columna: SinoChrom ODS-BP (5 µm, 4,6 × 200 mm)
• Destacar: Sensibilidad mejorada para B₁ y G₁ mediante derivatización poscolumna sin reactivos adicionales.

Las aflatoxinas son metabolitos tóxicos producidos por Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus que crecen en alimentos y piensos. Son altamente tóxicos y cancerígenos, siendo la aflatoxina B₁ la más potente. La contaminación puede ocurrir en cereales, nueces y sus productos derivados, especialmente en condiciones cálidas y húmedas. La detección normalmente requiere derivatización para mejorar la fluorescencia. Los métodos tradicionales de derivatización del ácido trifluoroacético (TFA) previo a la columna o del yodo posterior a la columna son complejos e implican reactivos peligrosos. La derivatización fotoquímica ofrece una alternativa más sencilla, segura y respetuosa con el medio ambiente. Esta solución, basada en GB/T 5009.23-2006, proporciona un flujo de trabajo completo para el análisis de aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂ en productos de cereales mediante HPLC con derivatización poscolumna.

Normas de aflatoxinas: aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂ (pureza apropiada para análisis cuantitativos); Metanol, grado HPLC; acetonitrilo, calidad HPLC; agua, desionizada (18,2 MΩ·cm);

Otros materiales: columnas de inmunoafinidad o cartuchos de extracción en fase sólida (para limpieza de muestras, según métodos estándar), papel de filtro de fibra de vidrio, tubos de centrífuga, matraces aforados, pipetas, etc.

Soluciones en stock: Prepare soluciones madre individuales de aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂ en metanol en concentraciones conocidas (p. ej., 1 a 10 μg/ml). Conservar protegido de la luz a baja temperatura (≤4°C).

Soluciones de trabajo mixtas: Diluir volúmenes apropiados de soluciones madre con fase móvil para preparar soluciones de trabajo estándar mixtas en las concentraciones deseadas. Para estudios de linealidad, la concentración típica varía: B₁ y G₁ de 0,2 a 20,0 μg/L; B₂ y G₂ de 0,06 a 6,0 μg/L.

Los pasos generales de la preparación de muestras incluyen:

• Extracción: Pesar una porción representativa de la muestra molida (por ejemplo, maíz, grano) y extraer con una solución de metanol y agua.
• Limpieza: Pasar el extracto a través de una columna de inmunoafinidad o un cartucho de extracción en fase sólida específico para aflatoxinas. Lavar para eliminar impurezas.
• Elución: Eluir las aflatoxinas con metanol o acetonitrilo.
• Concentración (si es necesario): Evaporar el eluato bajo una suave corriente de nitrógeno y reconstituir en fase móvil hasta un volumen conocido.
• Filtración: Filtrar a través de una membrana de 0,45 μm antes de la inyección por HPLC.

Opciones de configuración del sistema (Tabla 1):

Tabla 1. Opciones de configuración del sistema

Condiciones cromatográficas

• Columna: SinoChrom ODS-BP (5 µm, 4,6 × 200 mm)
• Fase Móvil: Metanol / Acetonitrilo / Agua = 20 : 20 : 60 (V/V/V)
• Tasa de flujo: 0,8 ml/min
• Detección: Detector de fluorescencia, longitud de onda de excitación 360 nm, longitud de onda de emisión 450 nm
• Derivatización posterior a la columna: Derivatizador fotoquímico (PD3110) instalado entre la columna y el detector
• Volumen de inyección: 20 µL
• Temperatura de la columna.: Ambiente

Separación estándar

En la Figura 1 se muestra un cromatograma típico de una solución estándar de aflatoxina mixta (20,0 μg/L) después de la derivatización fotoquímica. La derivatización mejora significativamente las señales de B₁ y G₁ y al mismo tiempo tiene un efecto mínimo sobre B₂ y G₂, como se resume en la Tabla 2.

Fig.1. Cromatograma de una solución estándar mixta (20,0 μg/mL) de aflatoxina

Tabla 2. Comparación de la respuesta antes y después de la derivatización

Límite de linealidad y detección

Las curvas de calibración se construyeron utilizando soluciones estándar mixtas en diversas concentraciones. Los límites de linealidad y detección se resumen en las Tablas 3.

Tabla 3. Ecuaciones lineales y coeficientes de correlación

Análisis de muestras

Se analizó una muestra de maíz comprada comercialmente siguiendo el procedimiento descrito. Los resultados se muestran en la Tabla 4 y la Figura 2.

Cuadro 4. Contenido de aflatoxinas en la muestra de maíz

Fig.2. Cromatograma de una solución estándar mixta de aflatoxinas (20,0 μg/mL) y una solución de muestra de maíz